Molekulyar-genetik tahlillar uchun zoologik namunalarni yig‘ish talablari. Genom DNKsini ajratish. PZR-amplifikatsiya. REJA: 1. Molekulyar-genetik tahlillarda zoologik namunalarni yig‘ish talablari. 2. Standart fenol-xloroform va kommersiyali reagent to‘plamlari yordamida umurtqasizlar namunasidan genom DNKsini ajratish. 3. PZR-amplifikatsiya o‘tqazish.

1. Molekulyar-genetik tahlillarda zoologik namunalarni yig‘ish talablari Zoologiya kuzatuv ob’ekti – ko‘p hujayrali (Animalia) va bir hujayrali organizmlar (protistlar) hisoblanadi. Molekulyar- genetik tahlil uchun namuna sifatida kuzatilayotgan umurtqasiz hayvon hajmiga qarab butun organizmlar (o‘lchami kamida 1 sm), tana qismlari, to‘qima va ichki organlar bo‘laklari xizmat qilishi mumkin. Maqbul namuna o‘lchami - 5 mm x 2-3 mm , og‘irligi 0.1 dan 5 g gacha. Molekulyar- genetik tahlil uchun zarur bo‘lgan materiallarni to‘plash jarayonida kerakli namuna DNK molekulasini destruktiv o‘zgarishini oldini olish maqsadida 70°S li chuqur muzlatuv holatiga tushirilishi yoki, 70% li etanol eritmasida (S 2 N 5 ON) belgilab qo‘yilmog‘i zarur. Tutish jarayonidan keyin organizm nobud bo‘lsa, namunani qayd qilish, 20-30 daqiqa mobaynida amalga oshirilishi zarur. Tekshirilayotgan hayvon namunalarni formaldegid eritmasi bilan fiksatsiya kilish yaroqsiz hisoblanadi, chunki formaldegid DNKga jiddiy tasir ko‘rsatadi, tanazulni olib keladi va taxlil natijalarini qisman yoki to‘liq buzilishiga sabab bo‘ladi. 70% li etanol eritmasida qayd qilingan namunalarni muzlatgichda saqlanishi maqsadga muvofiq bo‘ladi, agar bunday sharoit bo‘lmasa, xona haroritida quyosh nuri tushmaydigan joyda saqlanishi tavsiya qilinadi. Saqlash uchun 1-2 ml probirkalardan (eppendorflar) foydalaniladi. DNK va RNK ajratishni ta’minlashda bir qator prioritet talablarni ajratish mumkin: * – biologik materialni lizis i ; * – selektiv ekstraksiya (sorbsi ya ); * – katta xajmda to‘plash ; * – PZR susaytiruvchi komponentlardan ajratish ; * – DNK va RNK ajratish ; * – yuqori foizda chiqishi ; * – kalibrovk a mumkinligi va ijobiy nazorat ; * –kontaminatsi yaning yo‘qligi ;

* – kam vaqt sarflanishi ; * – avtomatizatsi yaning mumkinligi. E ukariot organizmlardan nuklein kislotalarni ajratish va fraksiyalashda traditsion va kommersion tayyor reagent-to‘plam usullari (naborda ishning bajarilish koidalari keltiriladi) foydalaniladi. Nuklein kislotalarni ajratish uchun tayyor reagent-to‘plamlar: 1. Fenol – xloroformli uslubi (FX- uslub). 2. Diatom DNA Prep (Rossiya) reagentlari to‘plami 3. Dneasy Tissue Kit (Germaniya) reagentlar to‘plami Fenol – xloroformli uslubi (FX- uslub). Bu usul nuklein kislotalarni ajratishning klassik uslubidir. Bu uslub proteinaza K ishtirokida detergentlar tomonidan biologik materiallarning parchalanishi hamda fenol va xloroform yordamida nuklein kislotalarni ajratib olishni o‘z ichiga oladi. Bu metodning afzalligi shundaki, bu uslub bilan anchagina ko‘p miqdorda DNK ajratib olinadi. Uslubning kamchiliklariga esa uning davomiyligi, mashaqqatliligi, agressiv organik erituvchilarning ishlatilishi va DNKni oqsildan ham, RNKdan ham yetarli darajada tozalamasligini kiritish mumkin. Diatom DNA Prep (Rossiya) reagentlari to‘plami yordamida DNK ajratish uslubi. Bu uslub reagentlar yordamida nukleotidlarni ekstraksiya qilish uslublaridan biri hisoblanadi. Bu to‘plam DNKni turli tabiiy materiallardan ajratish, shuningdek klinik namunalardan DNKni tez tozalab olish imkonini beradi. Bu usul FX – uslubdan jadalligi (1 ta namunaga 30 min. – 1,5 vaqt sarflanadi), toksik (zaharli) reagentlarning ishlatilmasligi bilan ajralib turadi. Lizis qiluvchi (parchalovchi) – reagant ishtirokida DNK Nucleos TM – sorbent to‘plamida faol so‘riladi, so‘ngra spirtli eritmada oqsil va tuzlardan oson yuviladi. Sorbentdan ajratilgan DNKni PZR da ishlatish mumkin. To‘plamni tarkibi: parchalovchi reagent, tuzli bufer Nucleos sorbentining suspenziyasi, “Ekstra Gen” ion almashinuvchi arlashma suspenziyasi Dneasy Tissue Kit (Germaniya) reagentlar to‘plami yordamida DNK ajratish uslubi. Dneasy Tissue Kit (QIAGEN GmbH, Germany) reagentlar

to‘plami afzalligi jinsiy voyaga yetgan xayvonlarning 10 mg to‘qimasidan tashqari, juda kichik o‘lchamdagi xayvon lichinkasi yoki tuxumidan genom DNKsini ajratish olish mumkin. Bunda xayvon to‘qimasining kichik bo‘lagi ajratib olinadi yoki pipetka bilan 1-2 dona lichinka yoki tuxumi olinadi va 1,5 ml li “Ependorf” probirkasiga solinadi. Namunalar og‘irligi 10 mg dan oshmasligi kerak. PZR-amplifikatsiyasi metodining asosiy tushunchalari. Polimeraza zanjir reaksiyasi (PZR) - in vitro amplifikatsiya metodi bo‘lib , uning yordamida qisqa vaqt mobaynida muayyan sondagi DNK ketma-ketligini odatdagidan 1000 marotaba ko‘proq tanlash yoki ko‘paytirish mumkin Metod mohiyati – probirkada muayyan DNK qismlarini qaytalanuvchi temperatura sikllarida ko‘p marotabali ko‘chirish (amplifikatsiya). Amplifikatsiyaning har bir siklida yuqorida sintezlangan fragmentlar yana DNK- polimeraza fermenti yordamida ko‘chiriladi va DNK fragmentlari o‘ziga xos ko‘p marotaba kattalashadi. PZR (PSR) tarixi. 1983 yil- Amerikaning «Gettus» firmasi xodimi Keri Myullis kaytalanuvchi xarorat sikllari yordamida probirkada DKN uchustkasining amplifikatsiya kilish metodini yaratdi. 1985 yil-Betta-gemoglobin uchustkasi amplifikatsiya kilindi (metodning dastlabki amaliyotda kullanilishi). 1989 yil « Science » jurnali polimeraza fermentini «yil molekulasi deb ta’rifladi. 1993 yil- Keri Myullis Nobel mukofoti bilan takdirlandi. PZR qo‘llanalish sohasi: 1. genom ketma-ketligini yuqori darajali klonlash 2. mitoxondriya va genom DNK larini to‘g‘ri sekvenerlash 3. nukleotid ketma-ketligi o‘zgaruvchanligini tahlil qilish 4. kasallik qo‘zg‘atuvchilarni aniqlash PSR bosqichlari: 1. DNK saklovchi namuna denaturatsiyaga uchratiladi 2. DNK bir zanjiriga praymerlar «yopishtiriladi» (bu vaktda xarorat pasaytiriladi) 3. DNK-polimeraza ishtirokida elongatsiya sodir buladi. 4. DNK yana denaturatsiyaga uchratiladi.

5. Yangi praymerlar «yopishtiriladi» 6. Polimeraza paraymerlarni kurib tugatadi. Endi 4 xolatga kaytib, sikl takrorlanadi (1-rasm). 1-Rasm. PSR bosqichlari Polimera zanjir reaksiyasini o‘tkazish uchun reaksion aralashmada zarur bo‘lgan tarkiblar: -Ikta praymer – su’niy yo‘l bilan sintezlangan. -DNK-polimeraza (Taq-polimeraza). -2'-dezoksinukleozid-5'-trifosfat aralashmasi (dNGF - dATF, dGTF, dSTF i dTTF) (Taq-polimeraza yordamida ikkinchi DNK zanjiri sintezi uchun foydalaniladi) -Bufer – ma’lum konsentratsiyadagi kation va anionlar aralashmasi bo‘lib, reaksiya uchun optimal sharoit yaratadi: stabil rN va eritmaning ion kuchi. - Tahlil qilinayotgan namuna – reaksiya aralashmasiga kiritish uchun tayyorlangan preparat bo‘lib, PZR-amplifikatsi yasi uchun nishon hisoblangan DNKni o‘zida saqlaydi. -Mg 2+ i on i (Taq-polimeraz a ishi uchun kerak) - Siklik temperatura rejimi Har bir amplifikatsiya sikli 3ta bosqichdan iborat: