O‘SIMLIKLARNING GENETIK MUHANDISLIGI Reja: 1. O‘simliklar gen muxandisligi. 2. Genni tanlash va uni klonlash 3. Genni kiritish va uning retsipient o‘simlik genomi d a gi ekspressi yasi 4. Transformant hujayralar regeneratsiyasi va transgen o‘simliklarni tanlash O‘simliklar gen muxandisligi. Jinsiy gibridizatsiya va tanlashga asoslangan an’anaviy seleksiya usullari o‘simliklarning yangi genotiplarini olish imkoniyatini beradi. Ular yirik hajmdagi qishloq ho‘jalik ekinlarining gibrid va navlari, shuningdek, seleksiyaning nodir nusxalarini olishni ta’minlaydi. YAngi navlarni olishda an’anaviy (klassik), seleksiya usullari bundan keyin ham asosiy usullardan bo‘lib xizmat qiladi. Gen muhandisligi manipulyasiyalari qishloq ho‘jalik ekinlarining patogenlarga chidamli yangi nav, shakl, liniya va gibridlarini olish va yangi navlarni joriy etish muddatlarini qisqartirish kabi qator muhim muammolarni echish imkoniyatini beradi. Rekombinant DNKlar texnologiyasi prokariot, shuningdek eukariot kelib chiqishga ega genlarni ajratish, bu gen (yoki bir necha genlar) retsipient o‘simlik xromosomasiga ko‘chirib o‘tkazish va uning ekspressiyasini ta’minlashga sharoit yaratadi. Bu texnologiyani qo‘llash izlanishni birmuncha aniq maqsadli qiladi va genetik apparat bilan manipulyasiya qilish imkoniyatlarini kengaytiradi. O‘simliklarning bitta hujayrasidan yaxlit o‘simlik olish mumkinligi, ya’ni totipotentlik xususiyati hayvonlar hujayralariga nisbatan ularning eng muhim afzalligi hisoblanadi. O‘simliklar gen muhandisligidagi natijalar o‘simlik to‘qimalari kulturasi usullari, ayniqsa, turli xil o‘simliklarni regeneratsiya qilish uslublarini ishlab chiqishga bog‘liq bo‘ladi. Gen muhandisligi texnologiyasi transgen o‘simlik olishning quyidagi bosqichlarini o‘z ichiga oladi: 1) genni tanlash va uni klonlash; 2) retsipient - o‘simlik genotipini tanlash; 3) genni kiritish va uning retsipient – o‘simlik genomiga ekspressiyasi; 4) transformant hujayralar regeneratsiyasi va transgen o‘simliklarni tanlash. 2. Genni tanlash va uni klonlash . Genni tanlash , o‘simlikka ho‘jalik ahamiyati qimmatli ma’lum bir belgini o‘tkazish zaruriyatidan kelib chiqadi. Hozirgi vaqtda , asosan , o‘simliklar transformatsiyasi uchun monogen belgilar, ya’ni , pestitsidlarga chidamlilik, yoki boshqa xil stress omillarga chidamlilikni belgilovchi genlar keng qo‘llaniladi. Bu belgilarga javobgar genlar ning ko‘pchiligi bakteriya g e nomlar i dan ajratib olingan. Keyingi vaqtlarda chidamlilik belgilariga javobgar donor sifatida yovvoyi o‘simlik turlari genomlari tanlanmoqda. Turli xil tur, avlod va hatto oilalarga mansub o‘simliklarning biologik jihatdan bir-biriga mos kelmasligi sababli b unday genlarni retsipient o‘simliklar genomiga jinsiy gibridizatsiya usuli orqaligina kiriti sh mumkin emas. Hal etilishi yanada murakkab muammo bir guruh sifat belgilari: urug‘ sifati, qurg‘oqchilik, yuqori va past haroratga chidamlilik belgilarini ajratib olish hisoblanadi. Retsipient o‘simlik genotipini tanlash . Retsipient sifatida ishlab chiqarish amaliyoti talablariga hosildorligi, urug‘ - mevasi sifati, biotik va abiotik stresslarga chidamliligi bilan javob bera oladigan, lekin faqat birgina salbiy belgi, masalan, zararkunanda hasharotga chidamsiz nav yoki liniyalar tanlab olinadi. Bunday o‘simliklar genomiga hasharotlarni nobud qiluvchi prototoksin oqsili ekspressiyasini ta’minlovchi v bt2 bakteriya genini kiritish tanlab olingan navda hosildorlikni sezilarli oshishiga sabab bo‘ladi. SHuningdek, retsipient o‘simlik genotipini tanlashda hujayralarning yaxlit (fertil) etuk o‘simlikka qadar regeneratsiya qilish xususiyati ham inobatga olinadi, chunki bu belgi genotipga ham bir qadar bog‘liqdir.

3. Genni kiritish va uning retsipient o‘simlik genomi d a gi ekspressi yasi . O‘simliklar genomiga begona genlarni ko‘chirib o‘tkazish muammosi begona genlarni ikki pallali va ba’zi bir pallali o‘simliklar genomiga ko‘chirib o‘tkazish imkoni ni beruvchi tuproq agrobakteriyalari Agrobacterium tumefaciens tarkibida gi Ti – plazmidlar i ning aniqlanishi bilan birmuncha engillashdi. So‘nggi vaqtlarda o‘simlik hujayralari transformatsiyasi da bioballistik transformatsiya usuli , ayniqsa, bir pallali o‘simliklar uchun keng qo‘llanilmoqda. Begona genni retsipient o‘simlik genomiga ekspressiyasini amalga oshirish va avlodlarda belgining nasldan – naslga tur g‘ un o‘tishini ta’minlash muhim masala hisoblanadi . Kiritilgan gen ni ekspressiya bo‘lishi bir qator sabablar : genni o‘simlik genomiga integratsiya bo‘lgan joyi , promotor qismining metillanish izchilligi, kiritilgan genning xususiyatlari va h.k. larga bog‘liq. 4. Transformant h ujayralar regeneratsiyasi va transgen o‘simliklarni tanlash. Transformant h ujayralardan etuk o‘simlikni regeneratsiya b o‘lishi h ujayralar totipotent ligi ga bog‘liq, ammo bu har doim ham amalga oshavermaydi. Totipoten t lik belgisi ikki pallali o‘simliklar: tamaki, kartoshka, lavlagi, soya, r a ps, beda, pomidor, sabzi, karam va ba’zi mevali daraxtlarda yaqqol ifodalangan. Bir pallalilar, ayniqsa, boshoqdoshlarda bu belgi kuchsiz ifodalangan bo‘lib, ularda hujayradan etuk o‘simlikni regeneratsiyasi jarayoni juda qiyinchiliklar bilan kechadi. Hozirgi vaqtda g‘alla ekinlariga mansub ba’zi o‘simliklar makkajo‘xori, sholi, bug‘doy, suli kabilarni regeneratsiya qilish usullari ishlab chiqilgan. SHuni qayd etish lozimki, ko‘plab o‘simliklarni regeneratsiya qilish bo‘yicha yildan yilga bir qator takomillashtirilgan usullar ishlab chiqilmoqda va rivojlantirilmoqda. O‘SIMLIK HUJAYRALARI TRANSFORMATSIYASI USULLARI Reja: 1. O‘simliklar xujayrasiga genlarni tansformatsiyalash 2. O‘simliklarga genlarni to‘g‘ridan - to‘g‘ri ko‘chirib o‘tkazish 3. DNK mikroin’eksiyasi 4. Elektroporatsiya 5. Liposomalarga joylashtirish 6. Bioballistik transformatsiyalar usuli 7. O‘simliklar transformatsiyasining dalillari 1 .O‘simliklar xujayrasiga genlarni tansformatsiyalash .Ikki pallali transgen o‘simliklar olishda eng keng tarqalgan usullardan biri agrobakteriyalar bilan kokultivatsiya qilish usuli hisoblanadi (2.9. - rasm). U o‘simlik eksplantlarini T-DNK hududiga begona gen joylashtirilgan vektor konstruksiyaga ega agrobakteriyalar bilan transformatsiya qilishga asoslangan. Uning keng tarqalganligining sababi, transformatsiyani amalga oshirishning birmuncha soddaligi transgen o‘simliklarni ajratib olishda yuqori (o‘simlik turiga qarab, 10-60 %) samaradorligi bilan izohlanadi. Dastlabki material uchun vektor (binar, koingegrativ yoki muayyan transformatsiya turi uchun yaroqli boshqa biror) konstruksiyaga ega bo‘lgan agrobakteriya shtammi bo‘lishi lozim. Vektor o‘simlik genomiga kiritilishi lozim bo‘lgan gen ketma-ketligiga ega bo‘lishi kerak. Genning kelib chiqishi (prokariot yoki eukariot) transformatsiya uchun ahamiyatsizdir, lekin u o‘simlik hujayrasiga ekspressiya bo‘la oladigan promotor nazorati ostida bo‘lishi lozim. Fuksional gendan tashqari , vektor, albatta, transformatsiyaning selektiv nishon belgisini saqlashi shart. Bunday nishon belgi sifatida antibiotiklar: k anamitsin ( npt -geni), gigromitsin ( npt -geni) va yoki gerbitsidlar xlorsulforon ( ALS - geni), fosfinotritsin ( bar - geni) (BASTA) ga chidamlilik belgisini yuzaga chiqaradigan genlar ishlatiladi. Bundan tashqari , retsipient – o‘simlik navlarini tanlab olish lozim. Transformatsiya uchun eksplant sifatida steril o‘simlik barg plastinkalari olinadi. Biroq buning uchun yosh ildiz lar

(arabidopsis da ), gipokotil (pomidor da ), urug‘palla (pomidor, baqlajon da ) , bo‘g‘im oralig‘i (kartoshka da ) h am ishlatilishi mumkin. Eksplantlarni vektor konstruksiyali agrobakteriyalar saqlovchi suyuq muhitida inokulyasiya qilinadi. Inokulyasiya qilish muddati h ar bir tur o‘simlik uchun alo h ida tanlab olinadi. Bunda eksplantning jarohatlangan yuzasida hujayralarning zararlanishi boshlanib, kokultivatsiyadan so‘ng 24 – 48 soat o‘tg a ch, T -DNK bo‘lagini begona (tanlab olingan) gen bilan birga o‘simlik genomiga joylashi shi sodir bo‘ladi. SHundan so‘ng, eksplantlarni antibiotiklar (karbenitsillin yoki sefot a ksi m) saqlovchi oz i qa mu h itiga o‘tkaziladi, bu agrobakteriya h ujayralarning tanl ab nobud bo‘lishiga sabab bo‘ladi. Bundan tashqari , oz i qa mu h itiga kerakli (to‘g‘ridan - to‘g‘ri regen e ratsiya yoki kallus h osil bo‘lishi uchun) fitog o rmonlar va transformant hujayralarni selektiv tanlab olish uchun antibiotiklar , gerbitsid qo‘ shi ladi. Antibiotik yoki gerbitsidga chidamlilik genlari ning ekspressiyasi ni amalga oshiruvchi ega transgen o‘simliklar selektiv agent qo‘shilgan mu h itda o‘sa olsa, transgen bo‘lmagan o‘simliklar bunday mu h itda nobud bo‘ladi. 2-5 h aftadan so‘ng transformant eksplantlardan po ya lar o‘sib chiqa boshlaydi, ularni ajratib olinadi yoki keyin gi qo‘shimcha molekulyar ta h lillar uchun tuproqqa ko‘chirib o‘tkaziladi (2. 9 . a – rasm). Protoplastlar shu yo‘sinda transformatsiya qili nadi, lekin bu usuldagi transformatsiya protoplastlarning o‘zida regeneratsiya qilish qobiliyati sustligi uchun kam s amara beradi. O‘simliklarga genlarni to‘g‘ridan - to‘g‘ri ko‘chirib o‘tkazish . O‘ simlik h ujayralariga genlarni to‘g‘ridan-to‘g‘ri ko‘chirib o‘tkazishda o‘simlik protoplastlarini ng transformatsiyasi keng qo‘llaniladi. O‘simlik h ujayra devoriga fermentlar (sellyul a za, pektin a za) bilan ishlov berilganda h ujayra devori emirilib, faqat protoplast qoladi. DNK ishtirokida p rotoplastlarni to‘g‘ridan - to‘g‘ri transformatsiya lash usuli ishlab chiqilgan. Transformatsiyaning birmuncha yuqori samaradorligiga (10 -2 ) elektroporatsiya va polietilenlik o l qo‘shish usuli orqali erishish mumkin. Agrobakteriyalar bilan transformatsiya qilishga nisbatan, to‘g‘ridan - to‘g‘ri ko‘chirib o‘tkazish usuli ning chastotasi kam bo‘lsa - da, birmuncha afzalliklarga ega. Vektor maxsus biologik signallar va transformatsiya funksiyalari (T -DNK hududi bilan chegaralangan va vir - hududi) ga ega bo‘lmasligi h am mumk i n. Transformatsiya uchun deyarli h ar qanday begona gen tutuvchi DNK vektori qo‘llanilishi mumkin. Bunda gibrid gen (faqat tegishli r e gulyator hududlar mavjud bulganida ) hujayra rekombinatsiyasi mexanizmlaridan foydalanib, ayniqsa, protoplast yadrosiga to‘g‘ridan - to‘g‘ri in’eksiya qilishda o‘simlik yadro DNK siga integratsiya bo‘ladi va ekspressiyalanadi . H ozirgi va q tda 140 dan orti q o‘ simlik turlari vektor DNKsini protoplast h ujayralariga turli usullar bilan k o‘ chirib o‘ tkazish orqali transformatsiya qilingan. DNK mikroin’eksiyasi . Bir qator tajribalarning ko‘rsatishicha, o‘simlik hujayralari transformatsiyasi uchun hayvon hujayralaridagi mikroin’eksiyalar singari mikroin’eksiyalari usulini qo‘llash mumkin. Bunda in’eksiya uchun protoplastlar olishda ularni polilizinli shishalarga yopishtirish usullari ishlab chiqilganligi qator texnik qiyinchiliklarni bartaraf etish imkoniyatini berdi (2.10-rasm). Vektor tipiga bog‘liq bo‘lmagan holda o‘simlik protoplastlari transformatsiyasi samaradorligi 10-15 % dan oshmaydi, u ikki pallali o‘simliklar uchun ham bir pallalilar uchun ham bir xilda muvofiq keladi. Elektroporatsiya . Bu usul yuqori impulsli kuchlanishlarning biomembranalar o‘tkazuvchanligini qaytar darajada oshirishga asoslangan. O‘simlik protoplastlari uchun elektroporatsiya muolajalari juda samarali hisoblanadi. Usulning mohiyati quyidagicha: DNK- vektorini saqlovchi yuqori konsentratsiyali eritmadagi o‘simlik protoplastlariga yuqori voltli impuls (kuchlanish 200-350 V, impuls davomiyligi 54 ms) bilan ta’sir etiladi (2.11-rasm). Natijada DNK molekulalari hujayra membranasidagi poralar (teshikchalar) orqali yutiladi. Eritma aralashtirilgandan

so‘ng protoplastlarni regeneratsiya bo‘lishi uchun etarli muhitga ekiladi. Ko‘chirib o‘tkazishning samarasi elektr shokidan so‘ng 24-28 soat o‘tgach aniqlanadi. Liposomalarga joylashtirish . O‘simlik protoplastlariga o‘tkaziladigan ekzogen genetik materialni nuklein kislotalarni parchalaydigan nukleazalar ta’siridan himoya qilishda qo‘llaniladigan usullardan biri liposamalarga joylashtirish usuli. Liposomalar qobig‘i fosfolipidlardan tashkil topgan sferik shakllar hisoblanadi. Ularni fosfolipidlarni suvli emulsiyalariga ultratovushlar bilan ishlov berish yoki qattiq chayqatish natijasida olish mumkin. Liposomalar yordamida o‘simlik protoplastlariga tamaki mozaikasi virusi RNK si, A.tumefaciens bakteriyasi Ti – plazmidasi DNK si, shuningdek, butun metafaza davri xromosomalari kiritilgan. Liposomalar yordamida ko‘chirib o‘tkazish tizimlarning afzalliklari sifatida ularning hujayralarga nisbatan zaharliligining kamligi, liposomalarni parchalash xususiyatiga ega hujayralari bo‘lgan ko‘plab o‘simliklarda ishlatish mumkinligini ko‘rsatish mumkin. Hozirgi vaqtga kelib, mazkur usul texnik jihatdan qiyinligi va transformatsiyalash faolligining nisbatan kam (0,5-1 %) ligi uchun tobora kam foydalanilmoqda. Bioballistik transformatsiyalar usuli . Bioballistika usuli bugungi kunga kelib, bir pallalilar uchun eng samarali usullardan hisoblanadi, shuningdek uni ikki pallali o‘simliklarda ham muvaffiqiyat bilan qo‘llash mumkin. Transformatsiya uchun dastlabki material sifatida kulturalar suspenziyasi, kallus to‘qimasi yoki bir pallalilarning etilmagan murtak o‘simtalari olinadi. Mazkur usulning mohiyati shundan iboratki, diametri 0,6-1,2 mkm bo‘lgan volfram, oltin yoki platina bo‘lakchalari transformatsiya uchun zarur gen konstruksiyalari saqlovchi DNK ustidan purkaladi. DNK tutuvchi volfram, platina yoki oltin bo‘lakchalari sellofan qobiq bilan o‘ralib, bioballistik zambarak ichiga joylashtiriladi. Kallus yoki hujayra suspenziyasi agarli oziqa muhiti solingan Petri likopchasiga o‘tkaziladi va bioballistik zambarak ro‘parasiga 10-15 sm masofada joylashtiriladi. Zambarakdagi bosim vakuum nasos bilan 1,0 atm gacha tushiriladi. Bosim tushiriladigan vaqtda zambarakdan volfram yoki oltin bo‘lakchalari otilib chiqib, hujayra devorini yorib o‘tadi va sitoplazmaga, hujayra yadrosiga o‘tadi. Odatda bevosita markazda joylashgan hujayralar volfram va oltin bo‘lakchalarining ko‘plab kelib urilishi va juda kuchli bosimi tufayli nobud bo‘ladi, ulardan 0,6-1 sm markazdan uzoqda esa transformant hujayralar joylashadi. SHundan so‘ng hujayralarni davomli ekish va regeneratsiya qilish uchun oziqa muhitlariga ko‘chirib o‘tkaziladi. Bioballistik zambaraklar yordamida bir pallali makkajo‘xori, sholi, bug‘doy, arpa o‘simliklari transformatsiya qilinib, turg‘un transgen o‘simliklar olingan. Bundan tashqari bioballistik transformatsiya DNK ni embriogen changchiga to‘g‘ridan-to‘g‘ri ko‘chirib o‘tkazish, transgen digaploid o‘simliklar olish uchun qo‘llaniladi va u seleksiya ishlarida muhim bosqich hisoblanadi. Bu usul bilan tamaki o‘simligining transformatsiyasi amalga oshirilib, gaploid o‘simliklar regeneratsiyasidan so‘ng turg‘un transfor-mantlar olingan. O‘simliklar transformatsiyasi ning dalillari. O‘simliklar transformatsiyasi vektorlari tarkibiga funksional gendan tashqari selektiv nishon gen lar i kiradi. Bu gen odatda antibiotiklar kanamitsin ( prtII -geni ) yoki gigromitsin ( prtII - gen i ) ga chidamlilik genlarini kodirlaydi, shuning uchun transgen o‘simliklarni dastlabki tanlov ishlarini tegishli antibiotiklar saqlovchi oz i qa mu h itlarida olib boriladi. Bunday mu h itda genomi tarkibida selektiv nishon geni bo‘lgan o‘simliklargina regeneratsiya qila oladi. Biroq selektiv mu h itda o‘sa olish xususiyatining o‘zi o‘simlikning transgen tabiatini isbotlovchi yagona dalil bo‘la olmaydi. T-DNK ketma-ketliklari borligi ni to‘liq isbotlashda polimeraza zanjir reaksiyasi (PZR) ta h lili va T-DNK bo‘lagi ni radioaktiv zond sifatida qo‘llash orqali transgen o‘simlik xromosoma DNK sining blot – gibridizatsiyasiga asoslangan molekulyar ta h lili o‘tkaziladi. Bunday ta h lillarni

o‘tkazish juda qimmat tursa - da, olingan natijalar transformatsiya amalga oshganligi, T-DNK – konstruksiyalarning qanchasi o‘simlik genomiga o‘rnasha olganligi to‘ g‘ risida ishonchli ma’lumot olish imkonini beradi. Bundan tashqari , funksional gen ekspressiyasining qo‘shimcha ta h lilini tegishli m RNK yoki oqsilni aniqlash usullari orqali amalga oshiriladi. AGROBAKTERIYALAR ASOSIDA O‘SIMLIKLAR TRANSFORMATSIYASI Reja: 1.Ti – plazmidalar asosida transformatsiya qilish uchun vektorlar 2.Kointegrativ vektorlar 3.Binar vektorlar Ri – plazmidasi asosida o‘simliklar transformatsiyasi 4.DNK saqlovchi viruslar asosidagi o‘simlik vektorlari 5.Ko‘chib yuruvchi genetik elementlar (transpozonlar) asosidagi vektorlar Ti – plazmidalar asosida transformatsiya qilish uchun vektorlar . Transgen o‘simliklar olishdagi asosiy muammolardan biri o‘simliklar xromosomasiga begona genlarni kiritish ya’ni, o‘simlik hujayralari transformatsiyasi hisoblandi. Bu borada tuproq agrobakteriyalari Ti – plazmidalaridan o‘simliklar transformatsiyasi tabiiy tizimida foydalanish imkoniyatining kashf etilishi muhim turtki bo‘ldi. Shish hosil qiluvchi kuchli induktorlardan biri Agrobacterium tumefaciens misolida shish chaqiruvchi vosita Ti – plazmida deb nomlangan (ingliz tilidan Tumor inducing – shish chaqiruvchi) maxsus plazmida bo‘lib, uning bir qismi o‘simlik hujayrasi xromosomasiga o‘rnashib olishi aniqlangan (2.1- rasm). Ti – plazmida uzunligi 200 m.n.j (ming nukleotid juft) dan iborat halqasimon DNK dan tashkil topgan. U bakteriya hujayralarida avtonom replikatsiya bo‘la olish xususiyatiga ega. Ti – plazmidalarni ular sintezlaydigan opinlar tipiga ko‘ra 4 ta guruhga bo‘lishi mumkin. Ko‘pincha nopalin yoki oktopin aminokislotalarini kodirlaydigan Ti – plazmidalar uchraydi. Agrobakteriya hujayrasi plazmidalarning faqat biri oktopin yoki nopalin kodirlaydigan tipini saqlashi mumkin. Ti – plazmidaning nodir biologik xususiyatlari uni genlarni ko‘chirib o‘tkazishdagi ideal tabiiy vektorga aylantiradi. Ti – plazmidasi ho‘jayinlarning keng spektriga ega, u T-DNK ni o‘simlik xromosomasiga o‘tkazadi, u erda T-DNK replikatsiyasi amalga oshadi va uning genlari oqsil hosil qilish bilan translyasiya bo‘ladi. T-DNK chegaralari uzunligi 25 nukleotid juftliklardan iborat takrorlanuvchi to‘g‘ri ketma-ketliklardan iborat bo‘lib, bu ketma-ketliklar oralig‘iga ulangan har qanday begona DNK bo‘lagi o‘simlik hujayrasiga o‘ta oladi. Biroq Ti – plazmidasi bilan ishlash uning katta o‘lchamdaligi sababli qiyinchilik tug‘diradi, an’anaviy usullarni qo‘llab, genni plazmidaga ulab bo‘lmaydi. SHuning uchun Ti – plazmida gen muhandisligi usullari yordamida modifikatsiya qilinib, uning asosida o‘simliklar transformatsiyasi uchun vektorlar olingan (2.4 - rasm). Kointegrativ vektorlar . Begona DNK ni o‘simlik genomiga kiritilishni osonlashtiruvchi usullardan biri kointegrativ vektorlardan foydalanish bo‘lib hisoblanadi. Bu yo‘nalishning mohiyati quyidagicha. Begona genni o‘simlik genomiga ko‘chirib o‘tkazishdagi barcha jarayonlarni 2 bosqichga bo‘linadi: o‘simlik genomiga kiritilishi lozim genni klonlash va o‘simlik hujayrasi genomi transformatsiyasini amalga oshirish. Bu ikkala bosqich turli xil vektorlar yordamida amalga oshiriladi. Kerakli genni klonlash uchun yordamchi (oraliq) vektor sifatida E. coli asosidagi plazmidalardan foydalaniladi. Ularga T-DNK ning chegaralangan T-DNK ketma-ketliklari fragmenti va selektiv (odatda, antibiotiklar kanamitsin, gigromitsin yoki gerbitsidga) chidamlilik belgisini